貨號
產(chǎn)品規(guī)格
售價
備注
BN20549-500ul/25T
500ul/25T
¥2800.00
BN20549-1ml/50T
1ml/50T
¥5200.00
產(chǎn)品描述
產(chǎn)品描述:偶聯(lián) anti-HA tag 納米抗體的瓊脂糖珠用于免疫沉淀 HA tag(YPYDVPDYA)的融合蛋白。
產(chǎn)品優(yōu)勢
? 沒有普通抗體的輕鏈和重鏈;
? 高親和力:解離常數(shù)達到 nM-pM 級別;
? 高載量:20ul 的 beads 懸液可以結(jié)合 2-5ug HA tag 的融合蛋白;
? 較短的孵育時間,結(jié)合 30-120 min 即可;
應(yīng)用范圍
可用于免疫沉淀(IP)/免疫共沉淀(CoIP)、染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)/RNA 結(jié)合蛋白免疫沉淀(RIP)、 酶活性測定、質(zhì)譜分析等;
特異性
可以結(jié)合 HA tag 的融合蛋白。
產(chǎn)品特性
存儲緩沖液:PBS(含有 20%乙醇)。 保存條件:可在 4℃保存至少 1 個月,在-20 度或-80℃保存 1 年,避免高速離心,干燥和反復(fù)凍融。
實驗原理
實驗步驟:
收集細胞:
每個免疫沉淀反應(yīng)大約使用 106-107 的哺乳動物細胞(約一個 10 厘米培養(yǎng)皿)表達綠色熒光蛋白融合蛋白。吸出生長培養(yǎng)基、向培養(yǎng)皿中加入 2 毫升預(yù)冷的 PBS 洗滌細胞 2 次,利用細胞刮或胰酶消化的方法收集貼壁細胞,細胞轉(zhuǎn)移到離心 管,500 g 離心 3-5 分鐘并丟棄上清液。
細胞裂解:
1.用 500 ul 預(yù)冷的裂解緩沖液重懸細胞,在裂解緩沖液中加入蛋白酶抑制劑(自備)。對于膜蛋白或核/染色質(zhì)蛋白,可使用 RIPA 裂解液(貨號:BN25012)中加入蛋白酶抑制劑(貨號:BN25002)。
2.把離心管放置在冰上 30 分鐘,可以每 10 分鐘充分吹打一次。
3.細胞裂解產(chǎn)物在 4℃,20,000 g 條件下離心 15 分鐘,轉(zhuǎn)移裂解產(chǎn)物到一個新的預(yù)冷管中,丟棄沉淀。注意:此時細胞 裂解產(chǎn)物可以放在-80℃進行長期儲存。
平衡珠子:
4.振蕩混勻 HA tag-Nanobody-Agarose Beads,吸取 20ul beads 懸液到 500 ul 預(yù)冷的裂解緩沖液中,在 4 ℃,2,500 g 條件下離心 3 分鐘,丟棄上清液。(此步驟可選) 結(jié)合蛋白
5. 將細胞裂解產(chǎn)物加入到平衡的 HA tag-Nanobody-Agarose Beads 中(如果未做第 4 步,可在細胞裂解產(chǎn)物中直接加入 20ul beads 懸液),在 4 ℃冷柜中的旋轉(zhuǎn)混合儀上結(jié)合 30-120 min。如果需要,保存 50 ul 的裂解產(chǎn)物進行免疫印跡分析。
6. 在 4 ℃,2,500 g 條件下離心 3 分鐘,丟棄上清液。
清洗珠子:
7. 用 500 ul 預(yù)冷的裂解緩沖液中洗滌 HA tag-Nanobody-Agarose Beads,在 4 ℃,2,500 g 條件下離心 3 分鐘,丟棄上清液并重復(fù)洗滌 2 次。(可選:在第二次洗滌的步驟中增加鹽濃度到 500 mM)。
洗脫蛋白:
方法一:
8. 加入 20ul 2X SDS-sample buffer 重懸 HA tag-Nanobody-Agarose Beads。在 95℃條件下加熱 10 min,把免疫沉淀復(fù)合物從珠子上游離出來,然后在 4 ℃,2,500 g 條件下離心 3 分鐘收集上清,進行免疫印跡分析。
方法二:
9. 替代步驟 8 的可選步驟:加入 50ul 0.2 M pH2.5 的甘氨酸洗脫結(jié)合的蛋白,建議孵育時間 30 秒,并不斷混勻,隨后離心,轉(zhuǎn)移上清液到新管中,為了中和酸性的甘氨酸,需添加 5ul 1.0 M Tris(pH10.4)。注意:為了提高洗脫效率可以重復(fù)這一步。
方法三:
10. 替代步驟 8 或 9 的可選步驟:也可以加入過量的 HA tag 的多肽進行洗脫。
產(chǎn)品效果:
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